Sujet de Thèse : yaduTaph : mobiliser le levier génétique pour lutter contre Taphrina deformans, responsable de la cloque du pêcher

Réduire l’emploi des pesticides pour une production plus durable de pêches impose de créer des variétés résistantes à la cloque du pêcher, maladie fongique causée par Taphrina deformans et participant largement à l’IFT élevé sur cette production. A ce jour, les variétés cultivées modernes sont toutes sensibles et aucune étude scientifique n’a dressé d’inventaire des sources potentielles de résistance ni exploré le déterminisme génétique des facteurs de résistance à la cloque. C’est pourtant une priorité pour l’avenir de la filière pêcher. Ce projet de thèse propose de prendre en main ce problème en mettant à profit la large gamme de matériel végétal disponible à INRAE et au-delà, déjà partiellement caractérisée. Il repose sur le phénotypage précis de ce matériel en conditions d’inoculum naturel ou par tests d’infection contrôlée après développement d’un protocole fiable. Des analyses de génétique de liaison et d’association, permettront d’identifier les loci contrôlant les résistances partielles, de les comparer, d’identifier des géniteurs d’intérêt et d’échafauder des plans de croisements pour pyramider les résistances. Le développement d’une méthodologie de caractérisation des variétés, de marqueurs moléculaires pour la SAM et de modèles de sélection génomique permettra de gagner en efficacité dans la lutte contre la cloque. Il y a urgence à réagir et valoriser les éléments accumulés par INRAE au cours du temps pour apporter une aide concrète à la filière sur une question primordiale.

Enjeux scientifiques et socio-économiques auxquels répond le projet

Réduire l’emploi des pesticides, une demande sociétale et environnementale

Il y a une pression croissante de la part de la société civile et des décideurs politiques pour réduire considérablement l'apport de produits chimiques de synthèse dans la production agricole. Ainsi en 2019, 89% des français souhaitaient une interdiction totale des pesticides d’ici 2024 (sondage IFOP), tandis que 43% se déclaraient inquiets sur les résidus de pesticides des fruits (baromètre Interfel). Les projets nationaux ECOPHYTO et ECOPHYTO II ne sont pas parvenus à réduire de manière significative l’emploi des produits phytosanitaires sur la durée (Hossard et al., 2017). Les fruitiers n’échappent pas à ce constat, avec des indices de fréquence de traitement demeurant élevés, allant jusqu’à 22 en PACA sur le pêcher en 2018 (Agreste).

Appliquer des pesticides à base de cuivre de façon répétée, principale source de pollution cuprique des sols agricoles

Le cuivre est traditionnellement utilisé en agriculture pour prévenir ou traiter certaines maladies fongiques et bactériennes des arbres fruitiers, de la vigne ou des productions légumières. Il constitue la seule matière active à effet fongicide fort et gamme d’action large homologuée en AB. Or des effets environnementaux délétères du cuivre ont été mis en évidence, notamment sur les organismes du sol et les auxiliaires des cultures, et des effets phytotoxiques sont reconnus sur la croissance et le développement de la plupart des plantes.

Fin 2018, la Commission européenne a renouvelé l’approbation du cuivre en tant que substance phytopharmaceutique pour une durée de 7 ans, assortie d’une limitation des quantités utilisables de 28 kg/ha sur 7 ans au maximum. L’expertise scientifique collective INRAE « Peut-on se passer de cuivre en agriculture biologique ? » (Expertise Cuivre 2018) dresse un panorama complet et scientifiquement fondé des usages, des alternatives disponibles, de leurs limites actuelles et des situations critiques du point de vue de son utilisation. L’État souhaite encourager cette transition et susciter la mobilisation de tous les acteurs des filières agricoles concernées pour réduire les usages de cuivre (Feuille de route pour la réduction de l’utilisation du cuivre en agriculture).

 Contrôler la cloque du pêcher, un défi oublié qui redevient un enjeu primordial

Chez le pêcher, les fongicides constituent le nombre de traitements le plus élevé et ceux appliqués pour lutter contre la cloque sont majoritaires (8 IFT cloque / 17 IFT fongicides et 24.2 IFT total, Essai EcoPêche 2016, Plenet et al., 2017). Après 10 ans d’essais sur Ecopêche 2 (Ecophyto Expé 2019 - 2023) à l’UERI de Gotheron les seuls traitements générant des IFT hors biocontrôle sur les systèmes économes en intrant sont les traitements contre la cloque. La cloque est une maladie fongique causée par le champignon Taphrina deformans. Si elle n'est pas contrôlée, elle peut détruire les pousses du printemps, conduire à l’affaiblissement de l'arbre et provoquer des pertes de récolte.  Sur plusieurs années, elle peut entraîner la mort de l'arbre, et ce d’autant plus vite que l’arbre est attaqué jeune. Aussi, une protection chimique préventive (quasi) systématique est appliquée (<a href="https://www.actu-environnement.com/media/pdf/news-25213-guide-ecophyto-fruits-methodologie.pdf">Guide méthodologique Ecophyto Fruits</a>), limitée à l’utilisation du cuivre en AB. Les perspectives de retrait de molécules et de limitation de l’utilisation du cuivre mettent la filière en péril. Les moyens de protection autres que la lutte chimique peuvent être de différente nature (Regnault-Roger C., Fabres Gérard, 2005) : contrôle génétique, systèmes de culture adaptés, lutte physique, lutte biologique et produits de biocontrôle. Or, de tels leviers d’action alternatifs ne sont pas suffisants pour lutter contre la cloque du pêcher. Aussi, beaucoup d’espoirs cristallisent autour du levier génétique, comme le suggèrent les conclusions majeures de l’Expertise Cuivre (2018) selon lesquelles la résistance/tolérance variétale est indispensable à tout système de protection sans cuivre.

 

Développer des variétés très peu sensibles à la cloque, grâce à la diversité génétique

Les acteurs de la filière (CTIFL, GRAB, Stations expérimentales, …) évaluent les variétés pour leur résistance à la cloque depuis deux décennies, et dressent des listes de variétés très sensibles et peu sensibles pour le conseil aux producteurs. Cette variabilité peut provenir de la précocité de la variété ou de ses caractères génétiques. Mais aucune variété résistante (absence complète de symptômes, ou petites nécroses témoignant de mécanismes d’hypersensibilité conférant une résistance complète) n’a été identifiée, ce qui suggère l’existence de résistances/tolérances partielles seulement, à déterminisme génétique complexe (nombreux loci ou QTL a effets faibles) et induisant un ralentissement plutôt qu’une absence de développement épidémique. Exerçant une pression de sélection moindre sur le pathogène, les résistances partielles sont supposées plus durables. De plus, le pyramidage, ou association de plusieurs facteurs de résistance au sein d’une même variété, est susceptible d’augmenter la durabilité de la résistance, en rendant le contournement plus difficile. Aussi l’identification de facteurs de résistance/tolérance partielle complémentaires et leur association dans une variété pourrait permettre d’augmenter le niveau de résistance tout en garantissant sa durabilité (Pilet-Nayel et al., 2017). En parallèle de l’effort de caractérisation des variétés cultivées, la diversité génétique disponible dans les collections (variétés anciennes, locales, exotiques…) est une ressource trop peu caractérisée et exploitée. De même, les espèces sauvages proches des espèces cultivées peuvent constituer un réservoir important et inédit de gènes de résistance (Dempewolf et al., 2017; Migicovsky & Myles, 2017). Enfin, les Prunus présentent un niveau de synténie important et les hybridations entre espèces sont possibles, ce qui permet de valoriser de très larges ressources génétiques. 

 

Etat de l’art scientifique – Originalité du projet

 La cloque, une maladie commune mais peu étudiée

Il existe 70 bioagresseurs des Prunus et seulement peu de pathosystèmes sont scrutés à la loupe (revu dans Aranzana et al 2019). Des mécanismes de résistance ont pu être identifiés par exemple pour le puceron, l’oïdium, les nématodes à galles, les tâches bactériennes et les monilioses chez le pêcher (Sauge et al., 2012; Yang et al., 2013; Lambert et al., 2016; Pascal et al., 2017; Esmenjaud et al., 2019; Duval et al., 2022), mais les sources de résistances sont rares dans le pool cultivé. L’unique publication rapportant une analyse génétique de la résistance à la cloque est une étude préliminaire publiée dans un acte de colloque en 1998 et issue d’un croisement interspécifique réalisé à INRAE d’Avignon (Viruel et al., 1998). Quelques travaux plus récents ont porté sur la comparaison de feuilles saines et infectées d’un point de vue anatomique (Giordani et al., 2013), biochimique (Koleva-Valkova et al., 2017; Moscatello et al., 2017), protéomique (Goldy et al., 2017; Butassi et al., 2022), métabolomique et transcriptomique (Svetaz et al., 2017) et le développement de tests moléculaires pour détecter la maladie (Tavares et al., 2004; Mikhailova et al., 2020). Ainsi les avancées scientifiques sont peu nombreuses et sporadiques, probablement pour trois raisons : i) il n’y a sans doute pas de gène majeur de résistance à la cloque dans les ressources génétiques connues du pêcher ; ii) la culture du champignon sur milieu artificiel n’était pas maitrisée, ce qui a limité les études de pathologie et empêché de réaliser des infections contrôlées et de cribler le matériel végétal existant. Le phénotypage se fait encore très largement en conditions naturelles sur des arbres non traités, au risque de mettre en péril la survie des arbres ; iii) les notations en conditions naturelles sont quantitatives et très dépendantes de facteurs multiples : météo, pression d’inoculum, phénologie, date d’observation… Une série de travaux a justement porté sur l’influence des facteurs climatiques sur le développement des infections ((Rossi & Languasco, 2007; Rossi et al., 2006, 2007b,a) et a permis d’adapter (Thomidis et al., 2010) un modèle ancien de prévision du risque cloque (Safran & Levy, 1995; Giosuè et al., 2000) malheureusement peu satisfaisants.

Maitriser l’infection contrôlée : lever le principal verrou au criblage du matériel végétal

Une équipe d’Argentine a récemment publié deux études notables (Svetaz et al., 2017; Butassi et al., 2022) mettant en œuvre des infections contrôlées sur feuilles détachées par une suspension de blastospores obtenue à partir de cultures du champignon sur un milieu peu commun (yeast malt agar YMA). La souche utilisée provient d’une collection portuguaise (PYCC 5894, Portuguese Yeast Culture Collection, Lisbon, Portugal ; https://pycc.bio-aware.com/). C’est une avancée remarquable qui va permettre de s’affranchir des conditions climatiques et de la pression naturelle de l’inoculum en verger pour cribler de façon systématique et répétable une large gamme de matériel, y compris les arbres maintenus sous tunnels et de jeunes arbres, sans mettre en péril leur conservation. On pourra également envisager des infections contrôlées en verger de façon à estimer le temps de latence entre infection et observation des premiers symptômes foliaires.

Tirer parti de l’ensemble du matériel végétal disponible

La génétique d’association permet d’identifier avec une bonne résolution des QTLs pour des caractères simples à moyennement complexes grâce à des panels optimisés de large diversité génétique (core-collections). Cette approche est répandue chez les espèces majeures mais à notre connaissance, seules deux études GWAS ont porté sur la résistance aux maladies chez les Prunus, l’une sur le chancre bactérien de l’abricotier (Omrani et al., 2019) et l’autre sur la moniliose du pêcher (Fu et al., 2021). Si la génétique d’association permet d’appréhender la diversité des core-collections et de bénéficier de nombreux évènements de recombinaison, les analyses de liaison en populations biparentales restent une méthode efficace pour valoriser les facteurs de résistance d’un parent déjà identifié comme peu sensible. La puissance de la méthode est d‘autant plus grande que le nombre d’individus est élevé. Les collections de variétés récentes évaluées sur plusieurs années par les stations expérimentales fruitières permettent quant à elles d’une part d’identifier des sources potentielles de facteurs de résistance (géniteurs des programmes de prébreeding) et d’autre part de tester les marqueurs moléculaires développés pour la sélection assistée par marqueurs (SAM) sur le pool cultivé. Les hybrides créés dans le cadre du programme INRAE de prébreeding, issus de croisements entre plusieurs géniteurs peu sensibles, sont également un matériel de choix pour valider les marqueurs de SAM. Dans un cas où l’architecture des facteurs de résistance est complexe, comme suspecté pour la cloque, la sélection génomique peut être une alternative efficace à la SAM. Quelques travaux préliminaires ont exploré cette stratégie et ont montré la faisabilité de la prédiction génomique chez les Prunus (Wanfang et al., 2022; Nsibi et al., 2018; Biscarini et al., 2017). Enfin, l’observation inédite de symptômes de cloque sur abricotier ces dernières années engendre un questionnement important : la cloque est-elle une maladie émergente de l’abricotier ?

 

Question de recherche proposée au candidat

 - Quelle est l’architecture génétique de l’immunité du pêcher face à la cloque ? Les déterminants génétiques de cette immunité sont-ils polymorphiques dans le pool génétique étendu de cette espèce ?

Les analyses de liaison phénotype-génotype dans la core-collection (analyse GWAS) ainsi que dans différentes populations (analyse QTL) permettront d’identifier les loci contrôlant la résistance à la cloque

 - Les sources de résistance/tolérance potentielles et les facteurs génétiques associés sont-ils différents ?

 - Peut-on développer des outils de phénotypage par inoculation pour un criblage efficace des ressources génétiques, des descendances et des hybrides ?

 - De la sélection assistée par marqueurs ou de la sélection génomique, laquelle des deux stratégies est la plus adaptée au modèle cloque/pêcher pour soutenir la création de variétés résistantes par sélection assistée par marqueurs ?

 - Est-il possible d’optimiser des schémas de croisement pour combiner des facteurs de résistance complémentaires et d’associer la résistance à la cloque à des résistances à d’autres maladies et pathogènes, notamment oïdium et puceron vert ?

Quel matériel disponible à INRAE permet de combiner facilement ces différentes résistances ?

 

Hypothèses de travail

- la résistance à la cloque est un caractère héritable qui ségrége dans les populations de pêcher

- des sources de résistance partielles sont présentes dans le réservoir génétique auquel nous avons accès (variétés cultivées et vieilles variétés, matériel exotique et espèces proches) : elles sont potentiellement différentes et complémentaires

- combiner des loci différents pour la résistance devraient permettre une résistance plus durable et de niveau plus élevé

 

Matériel nécessaire (disponible et/ou à produire), et méthodes envisagées

Nous disposons d’une série de différentes populations qui apporteront des éléments complémentaires au projet :

- une core-collection pêcher (206 individus), génotypée par la puce ‘IRSC 18K SNP array’ (https://www.rosaceae.org/Analysis/431), est plantée dans plusieurs environnements contrastés (Pyrénées Orientales, Vaucluse et Drôme plantés en hiver 2019-2020 et Gard en décembre 2022). Après 2 années de protection anti-fongique (pour éviter une mortalité importante des jeunes arbres), les vergers sont menés en bas intrants phytosanitaires, avec application de traitements ponctuels uniquement si la survie des arbres en dépend. Les notations de symptômes de cloque (pourcentage de feuilles attaquées) ont débuté en 2021 et sont reconduites tous les ans, ainsi que les notations de la date de débourrement végétatif. Cette core-collection permettra de réaliser des analyses d’association (GWAS).

 - des descendances issues de géniteurs différents et ségrégeant pour la sensibilité à la cloque:

  • Une population d’autofécondation (AF5392) de ‘Malo Konare’ (clone S5392), comptant 797 individus, plantée sur le Domaine expérimental INRAE de l’Amarine (Gard) et conduite sans protection fongique. ‘Malo Konare’ est une pêche pavie bulgare (Dabov, 1985), descendant d’un clone de P. ferganensis et montrant une forte résistance à l’oïdium (gène Vr1). 212 individus de AF5392 ont été génotypés avec la puce ‘IPSC peach 9K SNP array v1’ (Verde et al., 2012). Des notations de symptômes de cloque sont disponibles (2017, 2019, 2020, 2021 et 2022) et la population est encore en place. Les premières analyses QTL ont révélé sur le chromosome 7 un QTL stable au long des années, associé au locus contrôlant le caractère des nectaires foliaires (Lambert et al., 2022). Un QTL de résistance à l’oïdium est également présent dans cette région. Des autofécondations de certains individus de l’AF5392 ont été réalisées pour réaliser une cartographie fine de ce locus.
  • Des données observées sur la population d’autofécondation de SD40, individu issu d’un croisement interspécifique entre la nectarine Summergrand et le clone P1908 du pêcher sauvage P. davidiana. Ce dernier est porteur de résistances polygéniques à effet faible pour de nombreuses maladies. Ainsi, l’individu SD40 fait partie de la population SD étudiée pour la résistance à la cloque (Viruel et al., 1998). 6 QTL ont été identifiés dont 2 communs aux 2 années de notations. La population BC2, est issue de 2 générations d’un rétrocroisement (‘backcross’, BC) de l’individu SD40 d’abord avec la nectarine Summergrand pour obtenir la BC1, puis un mélange de pollen de la BC1 a servi à polliniser la nectarine Zéphir. Elle compte 123 individus génotypés avec des marqueurs microsatellites et la puce ‘IPSC peach 9K SNP array v1’ (carte de 340 marqueurs). Des observations de symptômes de cloque ont été réalisées en 2021 et 2022 alors que le verger était conduit sans protection fongique.
  • Une descendance F1 (propriété de AC fruit) issue du croisement entre Coraline et la variété rustique Bénédicte, la plus réputée peu sensible à la cloque, est génotypée par la puce IRSC 18K SNP. Les notations en 2021 ont permis de détecter 5 QTL provenant des 2 parents. Des descendances F2 sont en cours de construction (200 noyaux obtenus en 2022) à partir de 3 hybrides F1 hétérozygotes aux 5 QTL et seront génotypées et phénotypées pour préciser l’architecture génétique des résistances provenant des deux parents.

Au-delà de ces populations ciblées pour la cloque pourront être inoculées d’autres sources de diversité du compartiment Prunus, potentiellement porteuses de nouvelles sources de résistance:

  • Un croisement interspécifique pêcher x amandier
  • La collection de pêchers exotiques (chinois)
  • La core-collection abricotier, pour quantifier la gamme de sensibilité de cette espèce

Les analyses de liaison et d’association seront menées avec des packages R selon les modèles testés (multilocus, multicaractère, incorporer des covariables comme la date de débourrement végétatif) à l’aide des données des marqueurs individuels ou combinés en haplotypes (par ex. avec Haploview, basé sur le calcul du déséquilibre de liaison). Les environnements seront utilisés comme variables explicatives qualitatives (site A,B,C…) ou quantitatives (notamment l’hygrométrie et la température). L’architecture génétique de la résistance à la cloque pourra être déterminée et comparée sur l’ensemble des populations étudiées.

Une fois les zones d’intérêt identifiées, des marqueurs SNP seront développés i) pour densifier les zones des QTLs et réduire les intervalles de confiance et ii) et seront testés sur des collections pour développer la sélection assistée par marqueurs. Si l’architecture des traits de tolérance se révèlent très complexes, la sélection génomique sera envisagée en calibrant des modèles de prédiction génomique sur une population de référence, telle que la core-collection pêcher. A ce titre, le compartiment cultivé du pêcher pourra également être exploré sur du matériel en sélection, ou des variétés élites ou plus anciennes issues de nos ressources :

  • Les hybrides issus du programme de prebreeding INRAE visant à cumuler d’une part différents facteurs de résistance à une maladie ou un pathogène donné et d’autre part à associer des facteurs de résistance à différentes maladies et pathogènes sont plantés en verger pour observations en conditions naturelles. Ceux provenant de géniteurs de sources de résistance à la cloque permettront de valider les marqueurs identifiés sur la base du matériel précité. 
  • La collection pêcher maintenue au CRB Prunus à Toulenne (UE Arbo)
  • Les variétés en évaluation dans les stations expérimentales fruitières, pour lesquelles des observations de symptômes de cloque sont disponibles, serviront à tester les marqueurs développés dans ce projet sur un fond génétique commercial plus large.

 

 

Programme de recherches

- Développer la méthodologie permettant de réaliser des tests d’infection contrôlée pour évaluer la résistance à la cloque: culture de Taphrina deformans in vitro pour conservation et sporulation, réalisation de suspensions de blastospores, maitrise de l’infection sur feuilles détachées, mesures des symptômes. Comparaison de différentes souches.

- Phénotyper les collections et descendances en verger en conditions naturelles : notation des dates de débourrement végétatif et d’apparition des premiers symptômes et pourcentage de feuilles attaquées ; phénotyper par test en conditions contrôlées sur feuilles détachées des jeunes plants et des collections maintenues en tunnel (pas de traitement fongique ni d’attaque de cloque).

- Génotyper les nouvelles descendances F2 avec la puce ‘IRSC 18K SNP array’, développer des marqueurs pour préciser les zones des QTLs et pour la sélection assistée par marqueurs ; tester ces marqueurs sur des collections évaluées pour la cloque.

- Analyser les données phénotype-génotype par analyses de liaison (QTL) et d’association (GWAS) et comparer les résultats obtenus. Réaliser des cartographies fines des loci.

- Tester la performance de modèles de prédiction génomique.

- Optimiser le pyramidage des facteurs de résistance et les schémas de croisements ; réaliser des hybridations et tester les individus obtenus par marquage et phénotypage.

 

Calendrier

Année 1

Développement du test d’infection contrôlée, phénotypage en conditions naturelles et contrôlées, génotypage, hybridations, analyse de données de phénotypage pluriannuelles et multi-sites déjà disponibles, cartographie de QTL, analyses de GWAS et rédaction d’un article de revue.

Année 2

Poursuite des travaux de l’année 1, cartographie fine, comparaison des résultats issus des différentes populations, développement de marqueurs moléculaires et leur test dans des collections différentes et rédaction d’un article.

Année 3

Poursuite des travaux de l’année 2, tests de modèles de sélection génomique et réflexion sur l’optimisation des croisements, rédaction d’un article et du manuscrit de thèse.

 

Publications envisagées

- Une mini revue sur l’état de l’art de la recherche de sources de résistances/tolérances à cloque chez le pêcher

- Un article sur les résultats de QTL et GWAS : diversité des facteurs de résistance à la cloque du pêcher

- Un article sur la cartographie fine et le développement de méthodes de prédiction de la résistance/tolérance à l’aide de marqueurs par la SAM et la sélection génomique

 

Compétences cognitives et techniques acquises par le doctorant

Scientifiques et techniques : phénotypage, phytopathologie, génétique quantitative, biologie moléculaire, bioinformatique, gestion de jeux de données.

Compétences générales : communication scientifique orale, rédaction scientifique, compréhension des enjeux filières productions végétales, gestion de projet et travail d’équipe, esprit analytique et synthétique, encadrement de stagiaires.

 

Autres informations

En parallèle de ce projet de thèse, des travaux sont en cours, dans le cadre du projet Sensivar (FAM), sur l’identification des facteurs qui modulent l’infection par Taphrina deformans et la modélisation du risque d’infection. Ces travaux permettront de progresser dans notre connaissance des facteurs influençant le développement de l’infection.

De plus, Stéphanie Drusch de l’UERI de Gotheron débute des travaux expérimentaux (arbres en pot exposés à des événements climatiques différents) pour préciser les facteurs environnementaux déclenchant l’infection.

L’investissement limité des chercheurs du département SPE sur les maladies fongiques des Prunus explique la prise en charge de la partie mise au point de la culture de Taphrina deformans et des infections contrôlées par le GAFL. Mais nos voisins, les mycologues de l’unité de Pathologie Végétale, nous procureront les conseils et l’aide nécessaire pour mener à bien ces actions.

Dans le cadre du projet RésiDiv (CASDAR), on envisage de développer un outil pour quantifier les symptômes de cloque par imagerie. Le doctorant pourrait alimenter une base de données et éventuellement bénéficier de traits générés par l’analyse d’image acquises régulièrement pour des analyses en cinétique.

 

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Date de modification : 21 juin 2023 | Date de création : 06 mars 2023 | Rédaction : EJM